Абстракт
Необходимы эффективные и доступные методы лечения пациентов, страдающих коронавирусной болезнью 2019 года (COVID-19), вызванной тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2). Мы сообщаем об эффективности Artemisia annua in vitro.экстракты, а также артемизинин, артесунат и артеметер против SARS-CoV-2. Последние два являются одобренными активными фармацевтическими ингредиентами противомалярийных препаратов. Анализы противовирусного лечения «концентрация – ответ», основанные на иммуноокрашивании гликопротеина SARS-CoV-2, показали, что лечение всеми изученными экстрактами и соединениями подавляло инфицирование SARS-CoV-2 клеток VeroE6, клеток гепатомы человека Huh7.5 и рака легких человека A549 -hACE2 клетки, без очевидного влияния типа клеток на противовирусную эффективность. В тестах на лечение наиболее эффективным оказался артесунат (диапазон эффективных концентраций 50% (ЕС 50 ) в разных типах клеток: 7–12 мкг / мл), за ним следует артеметер (53–98 мкг / мл), A. annuaэкстракты (83–260 мкг / мл) и артемизинин (от 151 до не менее 208 мкг / мл). Индексы селективности (SI), рассчитанные на основе анализов лечения и жизнеспособности клеток, в основном были ниже 10 (диапазон от 2 до 54), что свидетельствует о небольшом терапевтическом окне. Эксперименты по времени добавления в клетках A549-hACE2 показали, что артесунат нацелен на SARS-CoV-2 на пост-входном уровне. Пиковые концентрации артесуната в плазме крови превышают значения ЕС 50 . Клинические исследования необходимы для дальнейшей оценки полезности этих соединений в качестве лечения COVID-19.
Вступление
Пандемия тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) 1 , 2 до июня 2021 года во всем мире была связана с более чем 3,9 миллионами смертей от коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) 3 , 4 , 5 . Это респираторное и системное заболевание с лихорадкой очень заразно и во многих случаях опасно для жизни. Ремдесивир - единственный противовирусный препарат прямого действия, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для лечения COVID-19; однако его клиническая эффективность недавно подверглась сомнению 6 , 7 , 8. Таким образом, лечение COVID-19 остается в значительной степени поддерживающим с острой необходимостью определения дополнительных противовирусных препаратов против SARS-CoV-2. Привлекательный подход - перепрофилирование лекарств, уже лицензированных для лечения других заболеваний. Растения A. annua использовались для лечения малярии в традиционной китайской медицине, а также в испытаниях на людях 9 , 10 и широко используются во многих африканских странах, хотя и вопреки рекомендациям ВОЗ. Артемизинин (рис. 1 , ( 1) ), сесквитерпеновый лактон с пероксидной составляющей и одно из многих биоактивных соединений, присутствующих в A. annua , является активным ингредиентом для лечения малярийных инфекций 11 , 12. Производные артемизинина артесунат (рис. 1 , ( 2) ) и артеметер (рис. 1 , ( 3) ) демонстрируют улучшенные фармакокинетические свойства и являются ключевыми активными фармацевтическими ингредиентами (API) рекомендованных ВОЗ комбинированных противомалярийных терапий, используемых в миллионах взрослых и детей каждый год с небольшими побочными эффектами 13 . Экстракты A. annua активны против различных вирусов, включая SARS-CoV 14 , 15 , 16 . Поэтому мы решили определить, действительно ли A. annuaэкстракты, а также чистый артемизинин, артесунат и артеметер активны против SARS-CoV-2 in vitro. С этой целью мы использовали различные системы культур клеток с пермиссивностью к SARS-CoV-2, клеточную линию почек африканской зеленой мартышки VeroE6, клеточную линию гепатомы человека Huh7.5 и клеточную линию рака легкого человека A549, конститутивно экспрессирующую человеческий ангиотензин-превращающий фермент 2. (ACE2) действует как рецептор проникновения SARS-CoV-2. Препараты на основе артемизинина были бы привлекательными кандидатами для повторного использования для лечения COVID-19, учитывая их превосходный профиль безопасности для людей, и поскольку они легко доступны для распространения по всему миру по относительно низкой цене.
Артемизинин и родственные производные API артесунат и артеметер.
Полученные результаты
Экстракты и соединения
Растения Artemisia annua, выращенные из посевной линии в Кентукки, США, экстрагировали абсолютным этанолом или дистиллированной водой при 50 ° C в течение 200 минут и анализировали, как описано в разделе « Материалы и методы » и дополнительной информации (рисунки S1 и S2 ). . Твердые вещества удаляли фильтрацией и растворители выпаривали. Экстрагированные материалы растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (этанольный экстракт) или смеси ДМСО: вода (3: 1 для водного экстракта) и фильтровали (см. Дополнительную информацию). Артемизинин (рис. 1 , ( 1 )) был синтезирован и очищен после процедуры , опубликованной или приобретенного 17 , в то время артезуната (рис. 1, ( 2 )) и артеметер (рис. 1 , ( 3 )) были получены только из коммерческих источников.
Анализы уменьшения образования бляшек в клетках VeroE6 для доказательства in vitro концепции эффективности экстрактов A. annua и артемизинина перед обработкой
Первоначальные эксперименты проводились в FU Berlin, Германия. Для первоначального скрининга, были ли экстракты и чистый артемизинин активными против SARS-CoV-2, их противовирусная активность была протестирована путем предварительной обработки клеток VeroE6 в разные моменты времени в течение 120 минут с выбранными концентрациями экстрактов или соединений до заражения первым европейским SARS- CoV-2, выделенный в Мюнхене (SARS-CoV-2 / человек / Германия / BavPat 1/2020). Затем смесь вирус-лекарство удаляли, и клетки покрывали средой, содержащей 1,3% карбоксиметилцеллюлозы, для предотвращения высвобождения вируса в среду. ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля. Число бляшек определяли либо путем непрямой иммунофлуоресценции с использованием смеси антител к белку SARS-CoV N 18, либо путем окрашивания кристаллическим фиолетовым 19.. Добавление либо этанольного, либо водного экстрактов A. annua перед добавлением вируса приводило к уменьшению образования бляшек в зависимости от концентрации, в то время как артемизинин проявлял небольшую противовирусную активность (дополнительные таблицы S1 - S8 ).
Эффективность экстрактов A. annua в анализах противовирусной терапии «концентрация – ответ» в клетках VeroE6
Эксперименты по концентрации и реакции проводились в больнице Копенгагенского университета в Видовре. В этих экспериментах использовался датский изолят SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 с использованием анализа противовирусной терапии на основе 96-луночного планшета, позволяющего проводить несколько повторов для каждой концентрации, поскольку описано в « Материалы и методы » и Дополнительная информация (Рисунки S3 и S4 ) 20 , 21. Семь повторов были измерены при каждой концентрации, и диапазон концентраций был оценен для повышения точности данных по сравнению с анализом уменьшения образования зубного налета, который проводился в двух повторах. Экстракты или соединения добавляли к клеткам VeroE6 либо за 1,5 часа до (предварительная обработка (pt)), либо через 1 час после инфицирования (обработка (t)), соответственно, с последующей 2-дневной инкубацией вируса с экстрактами или соединениями. Оба протокола дали аналогичные результаты с несколько более низкими значениями средней эффективной концентрации (ЕС 50 ), наблюдаемыми для анализов лечения.
Этанольный экстракт показал EC 50, равный 173 мкг / мл (pt) и 142 мкг / мл (t) (рис. 2 , 3 и таблица 1 ), в то время как водный экстракт был немного менее эффективен с EC 50 , равным 390 мкг / мл. (pt) и 260 мкг / мл (t) (рис. 2 , 3 и таблица 1 ). Для обоих экстрактов почти полное ингибирование вируса было достигнуто при высоких концентрациях: для этанольного экстракта A. annua при 333 мкг / мл (pt) и 444 мкг / мл (t) и водного экстракта A. annua при 875 мкг / мл ( pt) и 1009 мкг / мл (t) (рис. 2 и 3). Наивысшие оцененные концентрации, использованные в наших анализах, основывались на цитотоксичности экстрактов или соединений, поскольку оценивались только концентрации, приводящие к жизнеспособности клеток более 85% (рис. 2 , 3 , S5 и таблица 1 ). Анализы жизнеспособности клеток выявили средние цитотоксические концентрации (CC 50 ) 1044 мкг / мл ( этанольный экстракт A. annua ) и 2721 мкг / мл ( водный экстракт A. annua ) (рис. 2 , 3 , S5 и таблица 1 ). Индексы селективности (SI) определяли делением CC 50 на EC 50.и показали аналогичные результаты для этанольного экстракта A. annua (6 (pt) и 7 (t)) и водного экстракта A. annua (7 (pt) и 10 (t)) (Таблица 1 ).
Эффективность предварительной обработки экстрактов и соединений против SARS-CoV-2 в анализе противовирусной обработки «концентрация-ответ» в клетках VeroE6. Клетки VeroE6, высеянные накануне в 96-луночные планшеты, обрабатывали указанными концентрациями экстрактов ( A ) этанольного экстракта A. annua и ( B ) водного экстракта A. annua или соединений артемизинина ( C ), артесуната ( D ), и артеметер ( E ) за 1,5 часа до заражения SARS-CoV-2. После 2-дневной инкубации инфицированные клетки визуализировали с помощью иммуноокрашивания на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и автоматически подсчитывали, как описано в разделе « Материалы и методы.». % остаточной инфекционности для отдельных лунок рассчитывали путем соотнесения количества инфицированных обработанных лунок со средним числом 14 инфицированных необработанных контрольных лунок. Точки данных (красные точки) представляют собой средние значения семи повторов со стандартными ошибками средних значений (SEM), полученными в одном репрезентативном эксперименте. Сигмоидальные кривые доза-ответ (красные линии) были подогнаны, и значения EC 50 были рассчитаны в GraphPad Prism, как описано в разделе « Материалы и методы ». % Жизнеспособности клеток и значения CC 50 определяли в повторных анализах без заражения SARS-CoV-2, как описано в разделе « Материалы и методы.». Точки данных (синие треугольники) представляют собой средние значения трех повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Пунктирные красные / синие линии указывают концентрации, при которых ожидается противовирусный эффект (<70% остаточной инфекционности) / цитотоксический эффект (<90% жизнеспособности клеток) за счет ДМСО в соответствии с рисунком S6 .
Эффективность лечения экстрактами и соединениями против SARS-CoV-2 в анализе противовирусной обработки «концентрация – ответ» в клетках VeroE6. Клетки VeroE6, посеянные накануне в 96-луночные планшеты, были инфицированы SARS-CoV-2 и после 1 ч инкубации обработаны указанными концентрациями экстрактов ( A ) этанольного экстракта A. annua и ( B ) водного экстракта A. annua или соединения артемизинин ( C ), артесунат ( D ) и артеметер ( E ). После 2-дневной инкубации инфицированные клетки визуализировали с помощью иммуноокрашивания на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и автоматически подсчитывали, как описано в разделе « Материалы и методы.». % остаточной инфекционности для отдельных лунок рассчитывали путем соотнесения количества инфицированных обработанных лунок со средним числом 14 инфицированных необработанных контрольных лунок. Точки данных (красные точки) представляют собой средние значения семи повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Сигмоидальные кривые доза-ответ (красные линии) были подогнаны, и значения EC 50 были рассчитаны в GraphPad Prism, как описано в разделе « Материалы и методы ». % Жизнеспособности клеток и значения CC 50 определяли в повторных анализах без заражения SARS-CoV-2, как описано в разделе « Материалы и методы.». Точки данных (синие треугольники) представляют собой средние значения трех повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Пунктирные красные / синие линии указывают концентрации, при которых ожидается противовирусный эффект (<70% остаточной инфекционности) / цитотоксический эффект (<90% жизнеспособности клеток) за счет ДМСО в соответствии с рисунком S6 .
Таблица 1 Эффективность экстрактов и соединений in vitro.
Полноразмерный стол
Этанольный экстракт разбавляли ДМСО, что само по себе приводило к снижению жизнеспособности клеток до <90% при использовании в разведении 1:28, но не при разведении ≥ 1:42 (Рисунок S6 ). Таким образом, цитотоксичность, наблюдаемая при использовании экстракта в относительно высоких концентрациях, скорее всего, не была вызвана ДМСО (рис. 2 и 3 ). ДМСО в разведении> 1: 152, включая разведения, используемые в противовирусных анализах, не оказывал противовирусного действия, определяемого как снижение остаточной инфекционности до <70% (Рисунок S6 ). Таким образом, наблюдаемый противовирусный эффект тестируемого экстракта, скорее всего, не был вызван ДМСО.
Эффективность артемизинина и его производных в анализах противовирусной терапии концентрация-ответ в клетках VeroE6
Растения Artemisia annua содержат, помимо многих других биоактивных соединений, артемизинин, который отвечает за сильную противомалярийную активность A. annua . Чтобы выяснить, является ли артемизинин активным компонентом, ответственным за противовирусную активность растительных экстрактов, описанных выше, чистое соединение и синтетические производные были протестированы в анализах предварительной обработки и обработки. Артемизинин оказался активным в анализах SARS-CoV-2 с EC 50 238 мкг / мл (pt) и 151 мкг / мл (t) (рис. 2 , 3 и таблица 1).). Почти полное ингибирование вируса было достигнуто в обоих анализах при наивысшей концентрации, оцененной в анализах, 893 (pt) и 1208 мкг / мл (t). SI для артемизинина относительно высокий, 35 (pt) и 54 (t), исходя из CC 50, равного 8216 мкг / мл (рис. 2 , 3 , S5 и таблица 1 ). Наблюдаемая цитотоксичность артемизинина, по-видимому, была, по крайней мере, частично вызвана ДМСО, поскольку цитотоксичность наблюдалась только при разведении лекарственного средства, когда было обнаружено, что ДМСО снижает жизнеспособность клеток (рис. 2 , 3 и S6 ). Противовирусные эффекты наблюдались при использовании артемизинина при относительно высоких концентрациях, скорее всего , не связано с разбавителем ДМСО (рис. 2, 3 и S6 ).
Синтетическое производное артемизинина артесунат, API рекомендованных ВОЗ препаратов первого ряда для лечения малярии с улучшенными фармакокинетическими свойствами, показал наивысшую эффективность из всех протестированных соединений, при этом ЕС 50 составлял 12 мкг / мл (pt) и 7 мкг / мл (t). (Рис. 2 , 3 и Таблица 1 ). В анализе лечения близкое к полному подавление вируса было достигнуто при наивысшей оцененной концентрации (15 мкг / мл), как определено данными цитотоксичности, по сравнению с ингибированием 69% при этой концентрации в анализе перед обработкой. Более высокие концентрации артесуната не использовались из-за его цитотоксичности в этом анализе (CC 50 : 41 мкг / мл) (рис. 2 , 3 , S5., и таблица 1 ). SI 3 (pt) и 6 (t) были рассчитаны (Таблица 1 ). Цитотоксичность и противовирусные эффекты, наблюдаемые при использовании артесуната в относительно высоких концентрациях, скорее всего, не были связаны с разбавителем ДМСО (рис. 2 , 3 и S6 ).
Артеметер, другое производное артемизинина, которое используется во всем мире в качестве активного ингредиента в лекарствах от малярии, продемонстрировало промежуточную эффективность с EC 50 147 мкг / мл (pt) и 98 мкг / мл (t) (рис. 2 , 3 и таблица 1 ). . В анализе лечения близкое к полному подавление вируса было достигнуто при самых высоких концентрациях (≥ 153 мкг / мл), как определено данными цитотоксичности, по сравнению с ингибированием 52% при этой концентрации в анализе перед обработкой. С учетом цитотоксичности артеметера (CC 50 360 мкг / мл) были рассчитаны SI 2 (pt) и 4 (t) (рис. 2 , 3 , S5 и таблица 1).). Цитотоксичность, наблюдаемая при использовании артеметера в относительно высоких концентрациях, скорее всего, не была связана с разбавителем ДМСО (рис. 2 , 3 и S6 ).
Эффективность лечения на основе артемизинина в анализах противовирусного лечения «концентрация – ответ» с использованием клеток Huh7.5
Наблюдаемая противовирусная активность в этих анализах зависит от способности чистых соединений и соединений, содержащихся в экстрактах, проникать в клетки, а также от скорости их метаболизма в клетках. Чтобы исключить серьезные различия в эффективности экстрактов и соединений в клетках человека, анализы лечения также проводили на клетках гепатомы человека Huh7.5, добавляя экстракты или соединения к клеткам сразу после заражения. В целом, этанольный экстракт A. annua , артемизинин, артесунат и артеметер показали аналогичную эффективность в отношении Huh7.5 по сравнению с клетками VeroE6. Артесунат (EC 50 : 11 мкг / мл) снова оказался наиболее мощным соединением с почти полным ингибированием вируса при 22 мкг / мл и SI, равным 8, как определено CC 50, равным 93 мкг / мл (фиг. 4 , S7 и таблица 1 ). Артеметер (ЕС 50 : 64 мкг / мл) с 56% ингибированием вируса при наивысшей оцененной концентрации (65 мкг / мл) имел SI, равный 2, на основе CC 50, равного 127 мкг / мл (рис. 4 , S7 и Таблица 1 ). В клетках Huh7.5 EC 50 для спиртового экстракта A. annua составляла 118 мкг / мл с 76% ингибированием вируса при наивысшей оцененной концентрации (150 мкг / мл), как определено данными цитотоксичности; CC 50 составлял 483 мкг / мл, а SI - 4 (рис. 4 , S7 и таблица 1).). Артемизинин не показал значительного ингибирования вируса при наивысшей оцененной концентрации (208 мкг / мл) и SI <24, исходя из CC 50 5066 мкг / мл (фиг. 4 , S7 и таблица 1 ).
Эффективность лечения экстрактом A. annua и соединениями против SARS-CoV-2 в анализе противовирусной обработки «концентрация – ответ» в клетках Huh7.5. Клетки Huh7.5, посеянные накануне в 96-луночные планшеты, инфицировали SARS-CoV-2 и непосредственно обрабатывали указанными концентрациями этанольного экстракта A. annua ( A ) или соединений артемизинина ( B ), артесуната ( C ) и артеметер ( D ). После 3-дневной инкубации инфицированные клетки визуализировали с помощью иммуноокрашивания на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и автоматически подсчитывали, как описано в разделе « Материалы и методы.». % остаточной инфекционности для отдельных лунок рассчитывали путем соотнесения количества инфицированных обработанных лунок со средним числом 14 инфицированных необработанных контрольных лунок. Точки данных (красные точки) представляют собой средние значения семи повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Сигмоидальные кривые доза-ответ (красные линии) были подогнаны, и значения EC 50 были рассчитаны в GraphPad Prism, как описано в разделе « Материалы и методы ». % Жизнеспособности клеток и значения CC 50 определяли в повторных анализах без заражения SARS-CoV-2, как описано в разделе « Материалы и методы.». Точки данных (синие треугольники) представляют собой средние значения трех повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Пунктирные красные / синие линии указывают концентрации, при которых ожидается противовирусный эффект (<70% остаточной инфекционности) / цитотоксический эффект (<90% жизнеспособности клеток) за счет ДМСО в соответствии с рисунком S8 .
В клетках Huh7.5 ДМСО вызывал снижение жизнеспособности клеток до <90% при использовании в разведении 1:28, но не в разведениях ≥ 1:56 (Рисунок S8 ). Таким образом, цитотоксичность, наблюдаемая при использовании этанольного экстракта или чистых соединений в относительно высоких концентрациях, скорее всего, не была вызвана ДМСО (рис. 4 ). ДМСО в разведениях> 1: 179, включая разведения, используемые в противовирусных анализах, не оказывал противовирусных эффектов (рис. S8 ). Таким образом, наблюдаемый противовирусный эффект этанольного экстракта A. annua и чистых соединений, скорее всего, не был вызван ДМСО.
Эффективность лечения на основе артемизинина в анализах противовирусного лечения «концентрация – ответ» с использованием клеток A549-hACE2
Чтобы проверить наши результаты на другой физиологически релевантной модели клеточной культуры для противовирусных исследований SARS-CoV-2, мы провели анализы лечения на клетках рака легких человека A549, стабильно экспрессирующих рецептор входа SARS-CoV-2 человека ACE2 (клетки A549-hACE2). . В этих анализах этанольный экстракт A. annua , артемизинин, артесунат и артеметер показали такую же эффективность, как и в клетках VeroE6 и Huh7.5. Артесунат (ЕС 50 : 12 мкг / мл) снова оказался наиболее сильнодействующим соединением. Однако высокая цитотоксичность в клетках A549-hACE2 (SI 2, определенная с помощью CC 50 27 мкг / мл) помешала тестированию значительно более высоких концентраций, что привело к 63% ингибированию вируса при наивысшей оцененной концентрации (14 мкг / мл) (рис. 5 , S9 и Таблица1 ). Артеметер (ЕС 50 : 53 мкг / мл) с почти полным подавлением вируса при 92 мкг / мл имел SI 7, исходя из CC 50, равного 380 мкг / мл (рис. 5 , S9 и таблица 1 ). ЕС 50 для спиртового экстракта A. annua составлял 83 мкг / мл с почти полным ингибированием вируса при 178 мкг / мл; CC 50 составлял 506 мкг / мл, а SI составлял 6 (рис. 5 , S9 и таблица 1 ). Для артемизинина ЕС 50 составлял 168 мкг / мл; однако относительно высокая цитотоксичность в клетках A549-hACE2 (SI 9 определяется по CC 501527 мкг / мл) исключили тестирование более высоких концентраций (рис. 5 , S9 и таблица 1 ).
Эффективность лечения экстрактом A. annua и соединениями против SARS-CoV-2 в анализе противовирусной обработки «концентрация – ответ» в клетках A549-hACE2. Клетки A549-hACE2, посеянные накануне в 96-луночные планшеты, инфицировали SARS-CoV-2 и непосредственно обрабатывали указанными концентрациями этанольного экстракта A. annua ( A ) или соединений артемизинина ( B ), артесуната ( C ) и артеметер ( D ). После 2-дневной инкубации инфицированные клетки визуализировали с помощью иммуноокрашивания на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и автоматически подсчитывали, как описано в разделе « Материалы и методы.». % остаточной инфекционности для отдельных лунок рассчитывали путем соотнесения количества инфицированных обработанных лунок со средним числом 14 инфицированных необработанных контрольных лунок. Точки данных (красные точки) представляют собой средние значения семи повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Сигмоидальные кривые доза-ответ (красные линии) были подогнаны, и значения EC 50 были рассчитаны в GraphPad Prism, как описано в разделе « Материалы и методы ». % Жизнеспособности клеток и значения CC 50 определяли в повторных анализах без заражения SARS-CoV-2, как описано в разделе « Материалы и методы.». Точки данных (синие треугольники) представляют собой средние значения трех повторов с SEM, полученных в одном репрезентативном эксперименте. Пунктирные красные / синие линии указывают концентрации, при которых ожидается противовирусный эффект (<70% остаточной инфекционности) / цитотоксический эффект (<90% жизнеспособности клеток) ДМСО в соответствии с рисунком S10 .
В клетках A549-hACE2 ДМСО вызывал снижение жизнеспособности клеток до <90% при использовании в разведении 1:32, но не в разведениях ≥ 1:64 (рис. S10 ). Таким образом, цитотоксичность, наблюдаемая при использовании этанольного экстракта или чистых соединений в относительно высоких концентрациях, скорее всего, не была вызвана ДМСО (рис. 5 ). ДМСО в разведениях> 1: 141, включая разведения, используемые в противовирусных анализах, не оказывал противовирусных эффектов (рис. S10 ). Таким образом, наблюдаемый противовирусный эффект этанольного экстракта A. annua и чистых соединений, скорее всего, не был вызван ДМСО.
Артесунат заблокировал инфекцию SARS-CoV-2 на пост-начальном уровне
Чтобы получить представление о механизме действия артенусата, наиболее сильнодействующего соединения, исследованного в этом исследовании, мы провели анализ времени добавления в клетках A549-hACE2. Мы наблюдали, что добавление артесуната во время вирусной инокуляции (0 ч после инокуляции) в присутствии препарата в течение двухчасовой фазы вирусной инфекции не приводило к ингибированию инфекции SARS-CoV-2 ( Фиг.6 и S11 ). . Напротив, когда артесунат добавляли к клеткам в разные моменты времени после 2-часовой фазы вирусной инфекции (2 часа, 4 часа и 6 часов после инокуляции), всегда наблюдали по меньшей мере 80% ингибирование вирусной инфекции. По-видимому, артесунат нацелен на SARS-CoV-2 на пост-начальном уровне.
Анализ времени добавления артесуната. Клетки A549-hACE2 инфицировали SARS-CoV-2 в течение 2 часов. Артесунат в концентрации 14 мкг / мл добавляли в различные моменты времени после заражения вирусом: 0 ч, добавление во время инокуляции вируса с присутствием лекарственного средства в течение 2-часовой фазы вирусной инфекции; Через 2 часа, дополнительно через 2 часа после инокуляции, сразу после 2-часовой фазы вирусной инфекции; Через 4 часа и 6 часов, дополнительно через 4 и 6 часов после инокуляции, соответственно. После 2-дневной инкубации инфицированные клетки визуализировали с помощью иммуноокрашивания на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и автоматически подсчитывали, как описано в разделе « Материалы и методы.». % ингибирования рассчитывали как (100% -% остаточная инфекционность). % остаточной инфекционности для отдельных лунок рассчитывали путем соотнесения количества инфицированных обработанных лунок со средним числом 12 инфицированных необработанных контрольных лунок. Точки данных (столбцы) представляют собой средние значения шести повторов с SEM.
Обсуждение
Здесь мы демонстрируем in vitro эффективность лечения на основе артемизинина против SARS-CoV-2. Первоначально несколько экстрактов A. annua , а также артемизинин были проверены на противовирусную активность с использованием анализа уменьшения бляшек в клетках VeroE6 в условиях предварительной обработки с использованием немецкого штамма SARS-CoV-2 из Мюнхена. На основании этих результатов были детально изучены три экстракта A. annua и чистый синтетический артемизинин, артесунат и артеметер, чтобы построить кривые концентрация-ответ для экстрактов и соединений для предварительной обработки и лечения с использованием датского штамма SARS-CoV-2 из Копенгагена. в клетках VeroE6. Наконец, эффективность A. annua экстракт, а также артемизинин, артесунат и артеметер против датского штамма SARS-CoV-2 был подтвержден в клетках Huh7.5 и A549-hACE2.
Анализы «концентрация – реакция» на противовирусное лечение облегчили тестирование концентраций лекарств в нескольких повторностях, что привело к точным значениям EC 50 . В клетках VeroE6 значения EC 50 в условиях предварительной обработки были немного выше, чем значения EC 50, определенные в условиях обработки. Предварительная инкубация может оказать негативное влияние на стабильность экстрактов и чистых соединений, особенно если они нацелены на SARS-CoV-2 на поздней стадии жизненного цикла вируса, как было продемонстрировано здесь для артесуната и ранее для артеаннуина B, другого артемизинина. производная 22 . Как правило, EC 50значения зависят от конкретного используемого анализа. В то время как тип анализа, который мы использовали для однократной обработки и последующей инкубации вируса и лекарственного средства, является современным для измерения противовирусной эффективности, модификации анализа, такие как повторное введение лечения, могут привести к немного другим значениям EC 50 . Поскольку активное противовирусное вещество может быть метаболитом артемизинина, так что производные и экстракты артемизинина могут считаться пролекарствами, мы использовали клеточную линию гепатомы человека Huh7.5 и клеточную линию карциномы легкого человека A549, конститутивно экспрессирующие вход SARS-CoV-2. рецептор человеческого ACE2 (клетки A549-hACE2) для подтверждения EC 50определяется в клетках VeroE6. Таким образом, это исследование является первым, демонстрирующим активность лечения на основе артемизинина против SARS-CoV-2 в линиях клеток человека, включая клетки легких.
Хотя экстракты A. annua считались «естественными комбинированными методами лечения», поскольку они содержат несколько биоактивных соединений 23 , ВОЗ не рекомендует использовать нефармацевтические формы артемизинина в качестве терапевтического варианта для лечения малярии из-за отсутствия стандартизации в отношении его источников и приготовления. предполагающие риски неоптимальной эффективности и развития резистентности 24 . В этом контексте важно отметить, что экстракты, использованные в этом исследовании, были приготовлены из растений, выращенных в оптимизированных и стандартизованных условиях, таким образом, чтобы концентрации экстрагированного материала были воспроизводимы (подробности см. В дополнительной информации).
При сборе данных для этого исследования Cao et al. сообщили об эффективности производных артемизинина против изолята SARS-CoV-2 из Ухани в клетках VeroE6 22 . Хотя экстракты не изучались, эффективность артесуната была аналогичной при EC 50 13 мкМ по сравнению с 18 мкМ в нашем анализе лечения VeroE6. EC 50 для артеметера и артемизинина были в четыре и восемь раз выше в нашем анализе лечения VeroE6 по сравнению со значениями, указанными Cao et al . Это различие может быть связано с характером используемого анализа. Анализ, использованный Cao et al .был основан на определениях вирусной РНК, вирусный инокулят был удален после заражения / до лечения и, что, возможно, наиболее важно, анализ был прекращен через 24 часа после заражения, что, как ожидается, приведет к сравнительно более низкому EC 50 для соединений с ограниченной способностью контролировать вирус. В будущих исследованиях можно будет выяснить, почему артемизинин и артеметер показали более низкую эффективность, чем артесунат. Наконец, в нашем исследовании мы подтверждаем эффективность лечения на основе артемизинина двух европейских штаммов SARS-CoV-2 из Германии и Дании, которые более тесно связаны с большинством штаммов SARS-CoV-2, циркулирующих во всем мире, чем штамм Wuhan.
Учитывая наши результаты для артесуната и данные Cao et al. что касается артеаннуина B, лечение на основе артемизинина, вероятно, будет нацелено на SARS-CoV-2 на пост-начальном уровне. Для подтверждения этого наблюдения для различных производных артемизинина и растительных экстрактов потребуются будущие исследования. Хотя сообщалось о противовирусном эффекте артемизинина, его производных и растительных экстрактов для нескольких вирусов, точные механизмы действия еще предстоит выяснить 25 . Артесунат, API в одобренном Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США средствах против малярии, показал самую высокую эффективность против SARS-CoV-2 среди экстрактов и чистых соединений, протестированных на клетках VeroE6, Huh7.5 и A549-hACE2, за которым следует артеметер, A. annuaэкстракты и артемизинин. SI тестируемых экстрактов и соединений был относительно низким (в основном <10), что свидетельствует об относительно небольшом терапевтическом окне. Следует отметить, что некоторые препараты, такие как дигоксин со значением SI ниже 2, успешно используются в клинике 26 . Среди протестированных экстрактов и чистых соединений только артесунат показал значения ЕС 50 в диапазоне клинически достижимых концентраций в плазме и тканях. При внутривенном введении обычно используемых доз от 2 до 2,4 мг / кг зарегистрированные пиковые концентрации в плазме (Cmax) у пациентов составляли от 19,4 до 29,7 мкг / мл 27 . На основании этих наблюдений и наших данных лечения в клетках VeroE6, Huh7.5 и A549-ACE2 рассчитанная Cmax / EC 50значения от 1,6 до 4,2. В исследованиях на животных после введения разовой дозы артесуната концентрации в тканях, включая легкие, почки, кишечник и селезенку, были в несколько раз выше, чем концентрации в плазме 28 . Напротив, после введения артеметера сообщалось о значениях Cmax от 6 до 190 нг / мл, что на два или несколько порядков ниже определенных значений EC 50 . После приема чая артемизинин и A. annua были зарегистрированы значения Cmax от 240 до 776 нг / мл, что на два-три порядка ниже определенных значений EC 50 . Концентрации в плазме и тканях, которые могут быть достигнуты с помощью стандартизованного A. annuaэкстракты с высоким содержанием артемизинина, использованные в этом исследовании, еще предстоит определить. In vivo сообщалось об иммуномодулирующем эффекте лечения на основе артемизинина для этого класса лекарств 29 . Такие эффекты, которые могут включать передачу сигналов цитокинов, не могут быть отслежены в анализах in vitro, проводимых здесь, и в настоящее время изучаются в рамках текущих клинических испытаний фазы 1 и 2.
Материалы и методы
Приготовление экстрактов A. annua
Растворитель (250 мл этанола или дистиллированная вода) нагревали до 50 ° C в колбе Эрленмейера. Высушенный растительный материал (50 г для этанола, 25 г для воды) добавляли к растворителю и перемешивали в течение 200 мин. Смесь фильтровали и твердый материал промывали свежим этанолом или водой. Растворитель удаляли на роторном испарителе и твердый материал хранили при -30 ° C перед приготовлением образца. Высушенный экстракт нагревали до комнатной температуры. Необходимая масса образца удалялась шпателем. Добавляли ДМСО (3 мл, этанольные экстракты) или ДМСО: вода (3: 1, 8 мл водного экстракта) и смесь нагревали (40 ° C) для обеспечения сольватации. Раствор фильтровали с использованием шприцевого фильтра и хранили во флаконе с защелкиванием. Более подробная информация представлена в разделе «Дополнительная информация».
Качественный анализ экстрактов с помощью ВЭЖХ на дигидроартемизиновую кислоту и артемизинин.
Этаноловые экстракты A. annua анализировали с помощью системы Agilent 1260 Series, состоящей из автоматического пробоотборника, бинарного насоса и термостата колонки, соединенного с испарительным детектором светорассеяния (Agilent Infinity II ELSD) и масс-спектрометрическим детектором (Agilent). Перед анализом экстракт в ацетонитриле фильтровали с использованием целлюлозных шприцевых фильтров 0,45 мкм. Используя ацетонитрил / вода + 0,1 об.% Муравьиной кислоты (80/20 об. / Об.) При 1 мл / мин, образец пропускали через колонку Synergi C18 (250 × 4,6 мм, 4,6 мкм) (Phenomenex, Германия). Пример полученной хроматограммы показан на рисунке S2 .
Соединения
Артемизинин был либо синтезирован и очищен, как описано в дополнительной информации, либо приобретен (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Был приобретен артесунат (Selleckchem, Хьюстон, Техас, США или TCI, Эшборн, Германия). Был приобретен Артеметер (Selleckchem, Хьюстон, США). Соединения растворяли в ДМСО и замораживали. Подробная информация о приготовлении проб и нанесении компаундов приведена в разделе «Дополнительная информация».
Культура клеток
В FU Berlin клетки VeroE6 почек африканской зеленой мартышки (ATCC CRL-1586) поддерживали при 37 ° C с 5% CO 2 в минимальной необходимой среде (MEM; PAN Biotech, Aidenbach, Germany) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS ) (PAN Biotech), 100 МЕ / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина (Carl Roth, Карлсруэ, Германия).
В CO-HEP клетки VeroE6 почки африканской зеленой обезьяны (любезный подарок профессора Жана Дюбюиссона), а также клетки 30 гепатомы человека Huh7.5 поддерживали при 37 ° C с 5% CO 2 в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) (Invitrogen , Пейсли, Великобритания), содержащий 10% инактивированного нагреванием FBS (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) и 100 Ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина (Gibco / Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния, США). Клетки A549-hACE2 (Invivogen, Тулуза, Франция) поддерживали при 37 ° C с 5% CO 2.в среде Игла, модифицированной Дульбекко: смесь питательных веществ F-12 (Гибко, Пейсли, Великобритания), содержащая 10% инактивированной нагреванием FBS (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), 100 Ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина (Gibco / Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния, США) и 0,5 мкг / мл пуромицина (Invivogen, Тулуза, Франция). Клетки субкультивировали каждые 2–3 дня с использованием трипсина (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) для поддержания субконфлюэнтного клеточного слоя.
Изоляты вирусов
Изолят SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 / human / Germany / BavPat 1/2020 был предоставлен доктором Даниэлой Нимейер и профессором Кристианом Дростеном (Шарите, Берлин, Германия) и получен во время вспышки в Мюнхене, Германия. в феврале 2020 года.
Вирус SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 для исследований на клеточных культурах был получен после инокуляции клеток VeroE6 образцом мазка пациента, размножения вируса в клетках VeroE6 и создания последовательности, подтвержденной запасом 2-го пассажа вируса с помощью титр инфекционности 5,5 log TCID50 / мл, как описано у Ramirez et al. 20 .
Антивирусный анализ уменьшения образования зубного налета
Противовирусную активность производных артемизинина оценивали на клетках VeroE6, выращенных в течение ночи в 12-луночных планшетах (Sarstedt) при плотности приблизительно 5 × 10 5.ячеек / лунка. Клетки инкубировали в присутствии десятикратных серийных разведений соединений в течение 15 минут, 30 минут, 60 минут или 120 минут перед добавлением вируса в концентрации примерно 200 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на лунку в течение 120 мин. Смесь вирус-лекарство удаляли, и клетки покрывали MEM-FBS, содержащим 1,3% карбоксиметилцеллюлозу, для предотвращения высвобождения вируса в среду. ДМСО в среде для культивирования клеток в разведении 1: 100 (самая высокая концентрация относительно препаратов экстрактов / соединений) использовали в качестве отрицательного контроля, а количество вирусных бляшек определяли путем ручного подсчета бляшек после непрямой иммунофлуоресценции (IF) с использованием смесь антител к белку SARS-CoV N 18 или после окрашивания кристаллическим фиолетовым 19. Для IF клетки фиксировали 4% формалином и повышали проницаемость 0,25% Triton X-100. Неспецифическое связывание блокировали 1% FBS в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,25% Triton X-100 (PBS-T), при комнатной температуре в течение 30 минут. Клетки инкубировали с моноклональными антителами против N (разведение 1:25 в PBS-T) в течение 45 минут с последующей инкубацией со вторичными антителами (меченые Alexa 488 козьи антимышиные антитела в разведении 1: 500; Thermo Fisher). В каждом анализе каждую концентрацию тестировали в одной повторной культуре; В каждый анализ были включены пять инфицированных культур и культур, обработанных контрольным ДМСО. Количество бляшек, зарегистрированное в каждой инфицированной обработанной культуре, было связано со средним количеством бляшек в пяти контрольных культурах для расчета количества бляшек в процентах относительно контроля. Были проведены два независимых анализа.Таблица S1-S8 ). Выбранные концентрации были протестированы только в одном из анализов, и эти данные основаны на единичных повторах. Множественность инфекции (MOI) для инфекции была выбрана из расчета в среднем 150–250 бляшек на культуру.
Предварительная обработка и анализ противовирусного воздействия на концентрацию-ответ в клетках VeroE6
Были разработаны 96-луночную на основе противовирусных анализов в клетках VeroE6 на основе анализов , ранее установленные для оценки эффективности противовирусных препаратов против вируса гепатита С 31 , 32 . Клетки VeroE6 высевали из расчета 10 000 клеток на лунку 96-луночных планшетов, покрытых поли- D- лизином (Thermo Fisher Scientific, Рочестер, Нью-Йорк, США). Для анализов перед обработкой на следующий день среду заменяли на среду, содержащую экстракты или соединения, добавляя 50 мкл на лунку. После 1,5 ч инкубации при 37 ° C и 5% CO 2, клетки инокулировали SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 при MOI 0,0016 путем добавления 50 мкл разведенного исходного раствора вируса на лунку, что приводило к указанным концентрациям экстрактов или соединений. Для анализов обработки на следующий день среду заменяли добавлением 50 мкл свежей среды на лунку. Затем клетки инокулировали SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 при MOI 0,0016 путем добавления 50 мкл разведенного исходного раствора вируса на лунку. MOI были выбраны для получения явно инфицированных культур с количеством инфицированных клеток в целевом диапазоне, указанном в разделе об иммуноокрашивании и оценке 96-луночных планшетов ниже. Кроме того, были выбраны MOI, чтобы избежать индуцированных вирусом цитопатических эффектов во время анализа. Через час после инокуляции вируса и инкубации при 37 ° C с 5% CO 2Добавляли 50 мкл среды, содержащей экстракты или соединения, что приводило к указанным концентрациям; в качестве альтернативы добавляли 50 мкл среды, содержащей разбавитель (ДМСО), что приводило к указанным разведениям. Для обоих анализов в каждом независимом эксперименте каждую концентрацию / разведение тестировали в семи повторах; 14 инфицированных и необработанных, а также 12 неинфицированных и необработанных контрольных лунок были включены в каждый анализ. После 48 ± 2 ч инкубации при 37 ° C и 5% CO 2 культуры иммуноокрашивали на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и оценивали, как описано ниже.
Анализ противовирусной обработки "концентрация-ответ" в клетках Huh7.5
Клетки Huh7.5 высевали из расчета 8000 клеток на лунку 96-луночных планшетов с плоским дном (Thermo Fisher Scientific, Роскилле, Дания). На следующий день клетки инокулировали SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 при MOI 0,0198 путем добавления 50 мкл разведенного исходного раствора вируса на лунку. MOI были выбраны для получения явно инфицированных культур с количеством инфицированных клеток в целевом диапазоне, указанном в разделе об иммуноокрашивании и оценке 96-луночных планшетов ниже. Кроме того, были выбраны MOI, чтобы избежать индуцированных вирусом цитопатических эффектов во время анализа. Непосредственно после инокуляции вируса добавляли 50 мкл среды, содержащей экстракты или соединения, что приводило к указанным концентрациям; в качестве альтернативы добавляли 50 мкл среды, содержащей разбавитель (ДМСО), что приводило к указанным разведениям. В каждом независимом эксперименте каждую концентрацию тестировали в семи повторах; В анализ были включены 14 инфицированных и необработанных, а также 12 неинфицированных и необработанных контрольных лунок. Через 72 ± 2 ч инкубации при 37 ° C и 5% CO.2 , культуры иммуноокрашивали на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и оценивали, как описано ниже.
Анализ противовирусной обработки "концентрация-ответ" в клетках A549-hACE2
Клетки A549-hACE2 высевали из расчета 10000 клеток на лунку 96-луночных планшетов с плоским дном (Thermo Fisher Scientific, Роскилле, Дания). На следующий день клетки инокулировали SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 при MOI 0,0025 путем добавления 50 мкл разведенного исходного раствора вируса на лунку. MOI были выбраны для получения явно инфицированных культур с количеством инфицированных клеток в целевом диапазоне, указанном в разделе об иммуноокрашивании и оценке 96-луночных планшетов ниже. Кроме того, были выбраны MOI, чтобы избежать индуцированных вирусом цитопатических эффектов во время анализа. Непосредственно после инокуляции вируса добавляли 50 мкл среды, содержащей экстракты или соединения, что приводило к указанным концентрациям; в качестве альтернативы добавляли 50 мкл среды, содержащей разбавитель (ДМСО), что приводило к указанным разведениям. В каждом независимом эксперименте каждую концентрацию тестировали в семи повторах; В анализ были включены 14 инфицированных и необработанных, а также 12 неинфицированных и необработанных контрольных лунок. Через 48 ± 2 ч инкубации при 37 ° C и 5% CO2 , культуры иммуноокрашивали на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и оценивали, как описано ниже.
Время добавления артесуната
Клетки A549-hACE2 высевали из расчета 10000 клеток на лунку 96-луночных планшетов с плоским дном (Thermo Fisher Scientific, Роскилле, Дания). На следующий день клетки инокулировали SARS-CoV-2 / human / Denmark / DK-AHH1 / 2020 при MOI 0,005 путем добавления 50 мкл разведенного исходного раствора вируса на лунку. Супернатанты, содержащие вирус, удаляли через 2 ч инкубации, а лунки промывали один раз 130 мкл PBS. Сразу после этого добавляли 50 мкл среды. В разные моменты времени во время эксперимента добавляли 50 мкл среды, содержащей артесунат, что приводило к конечной концентрации 14 мкг / мл: 0 ч после инокуляции, добавление во время инокуляции вируса с присутствием лекарства во время 2-часовой фазы вирусной инфекции. ; Через 2 часа, дополнительно через 2 часа после инокуляции, сразу после 2-часовой фазы вирусной инфекции; Через 4 и 6 часов, дополнительно через 4 и 6 часов после инокуляции, соответственно.2 . Через 48 ± 2 ч после инокуляции культуры иммуноокрашивали на гликопротеин шипов SARS-CoV-2 и оценивали, как описано ниже. 96-луночные изображения этого эксперимента с клетками A549-hACE2 показаны на Фигуре S11 .
Иммуноокрашивание и оценка 96-луночных планшетов для противовирусной обработки концентрация-ответ и анализов времени добавления
Клетки фиксировали и вирус инактивировали погружением планшетов в метанол (JTBaker, Гливице, Польша) на 20 мин. Если не указано иное, иммуноокрашивание проводили при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали PBS (Sigma, Gillingham, UK), содержащим 0,1% Tween-20 (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA). Эндогенная пероксидазная активность блокировалась инкубацией с 3% H 2 O 2.в течение десяти минут с последующими двумя промываниями PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и блокированием PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (Roche, Mannheim, Германия) и 0,2% сухого обезжиренного молока (Easis, Aarhus, Дания) в течение 30 минут. После удаления блокирующего раствора планшеты инкубировали с первичными химерными моноклональными антителами SARS-CoV-2 (Sino Biological # 40150-D004, Пекин, Китай), разведенными 1: 5000 в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,2% обезжиренного молока. порошок на ночь при 4 ℃. После двух промывок PBS, содержащим 0,1% твин-20, планшеты инкубировали с вторичным антителом F (ab ') 2-козьим вторичным перекрестно адсорбированным антителом против человеческого IgG Fc, HRP (Invitrogen # A24476, Карлсбад, Калифорния, США) или Козий F (ab ') 2 против IgG человека - Fc (HRP), предварительно адсорбированный (Abcamab # 98595, Кембридж, Великобритания), разведенный 1: 2000 в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,2% сухого обезжиренного молока, в течение 2 часов. После двух промывок PBS, содержащим 0,1% Tween-20, гликопротеин SARS-CoV-2 был визуализирован с использованием субстрата DAB (Immunologic # BS04-110, Duiven, Нидерланды). Клетки с положительным спайк-белком подсчитывали автоматически с использованием УФ-анализатора ImmunoSpot series 5 (CTL Europe GmbH, Бонн, Германия), как описано31 , 32 , 33 . Среднее количество 12 неинфицированных необработанных контрольных лунок, которое обычно было <50, вычитали из числа инфицированных лунок. Подсчеты, записанные в каждой инфицированной обработанной лунке, были связаны со средним числом 14 инфицированных необработанных контрольных лунок для расчета% остаточной инфекционности. Данные, приведенные на рисунках, представляют собой средние значения семи повторов из одного независимого эксперимента со стандартными ошибками средних значений (SEM). Сигмоидальные кривые доза-ответ былиподобраны,изначенияEC 50 были рассчитаны с помощью GraphPad Prism 8.0.0 с использованием нижнего ограничения 0 и формулы Y = Top / (1 + 10 ^ ((LogEC 50-X) * HillSlope)). MOI для инфекции был выбран из расчета в среднем 3000–4000 отсчетов на лунку для клеток VeroE6 и клеток A549-hACE2 и в среднем 300–600 отсчетов на лунку для менее пермиссивных клеток Huh7.5 в инфицированных необработанных контрольных лунках после прекращения соответствующие анализы. Репрезентативные 96-луночные изображения из анализов на клетках VeroE6 показаны на рисунке S3, а репрезентативные изображения отдельных лунок показаны на рисунке S4 .
Анализы жизнеспособности клеток VeroE6, Huh7.5 и A549-hACE2
Чтобы оценить цитотоксические эффекты тестируемых экстрактов, соединений и разбавителей (ДМСО), жизнеспособность клеток контролировали с помощью анализа пролиферации клеток CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Клетки VeroE6, клетки Huh7.5 или клетки A549-hACE2 высевали из расчета 10000, 8000 или 10000 клеток на лунку 96-луночных планшетов с плоским дном, соответственно (Thermo Fisher Scientific, Роскилле, Дания). На следующий день среду заменяли, чтобы она содержала определенные концентрации экстрактов или соединений или разведения ДМСО, добавляя 100 мкл на лунку. Каждую концентрацию или разведение тестировали в 3-х повторностях; В анализ были включены по крайней мере 6 необработанных контрольных лунок. Для клеток VeroE6 и клеток A549-hACE2 через 48 ± 2 ч, а для клеток Huh7.5 через 72 ± 2 часа инкубации при 37 ° C и 5% CO 2., 20 мкл реагента CellTiter 96 AQueous One Solution добавляли на лунку, и планшеты инкубировали в течение 1,5–2 часов при 37 ° C и 5% CO 2 перед регистрацией оптической плотности при 492 нм с использованием считывающего устройства для 96-луночных планшетов FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Оффенбург, Германия). Абсорбция, зарегистрированная в каждой лунке, была связана со средней абсорбцией необработанных контрольных лунок для расчета процента жизнеспособности клеток. Данные, приведенные на рисунках, являются средними значениями трех повторностей из одного независимого эксперимента с SEM. Сигмоидальные кривые доза-ответ были подобраны, и средние значения цитотоксической концентрации (CC 50 ) были рассчитаны с помощью GraphPad Prism 8.0.0 с использованием нижнего ограничения 0 и формулы Y = Top / (1 + 10 ^ ((LogCC 50 -X) * HillSlope )), как показано на рисунках S5., S7 и S9 . Чтобы исключить цитотоксические эффекты при концентрациях, выбранных на основе анализов жизнеспособности клеток в присутствии вирусной инфекции, лунки для культивирования в антивирусных анализах проверяли вручную в световом микроскопе.
Сокращения
API:
Активные фармацевтические ингредиенты
CC 50 :
Средняя цитотоксическая концентрация
COVID-19:
Коронавирус заболевание 2019
ДМСО:
Диметилсульфоксид
EC 50 :
Средняя эффективная концентрация
FBS:
Фетальная бычья сыворотка
FDA:
Управление по контролю за продуктами и лекарствами
hACE2:
человеческий ангиотензин-превращающий фермент 2
ЕСЛИ:
Иммунофлуоресценция
MOI:
Множественность заражения
PBS:
Физиологический раствор с фосфатным буфером
SARS-CoV-2:
Тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2
SD:
Стандартное отклонение
SEM:
Стандартная ошибка среднего
SI:
Индекс селективности.
.jpg)
.png)
Комментарии